Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題分析（一）

點(diǎn)擊次數(shù)：2235次發(fā)布時(shí)間：2019/7/16 6:31:05

Western Blot，通常我們?cè)谌粘＝涣髦姓f(shuō)的就是簡(jiǎn)稱“WB”，中文名稱是“蛋白印跡”或“免疫印跡”，其核心本質(zhì)是抗原抗體的特異性反應(yīng)。Western Blot的基本原理是蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠電泳后，按分子量大小順序在分離膠中分離開(kāi)來(lái)，通過(guò)轉(zhuǎn)膜可將膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（通常是PVDF膜、NC膜和尼龍膜）表面，然后加入一抗去特異性結(jié)合膜上蛋白質(zhì)，再加入酶或者熒光素標(biāo)記的二抗，二抗與一抗結(jié)合反應(yīng)后，通過(guò)底物顯色、化學(xué)發(fā)光等方法檢測(cè)目的蛋白。Western Blot實(shí)驗(yàn)一般用來(lái)判斷特定蛋白在樣本中是否表達(dá)及粗略分析特定蛋白表達(dá)量的高低。

Western Blot是實(shí)驗(yàn)室中常見(jiàn)且重要的一種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，一次完整的實(shí)驗(yàn)一般需要兩天時(shí)間，當(dāng)我們對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿懷期待or充滿信心，也許現(xiàn)實(shí)會(huì)給我們一記響亮的耳光。

下面，小科整理了一些Western Blot 結(jié)果常見(jiàn)問(wèn)題：

/ 條帶弱 /

原因分析1：抗原量不足；

解決方案1：上樣前做蛋白定量，增大上樣量；

蛋白定量的意義：保證各處理組總蛋白上樣量一致,蛋白總量不足可能妨礙對(duì)目的蛋白的鑒定，蛋白含量太高會(huì)使條帶扭曲，影響電泳的分辨力；

原因分析2：蛋白質(zhì)儲(chǔ)存過(guò)程中降解；

解決方案2：重新制備樣品；

原因分析3：膜錯(cuò)誤選擇，轉(zhuǎn)膜不完全；

解決方案3：選擇合適的轉(zhuǎn)印膜：大蛋白（＞20KDa）選大孔膜（0.45μm），小蛋白（＜20KDa）選小孔膜（0.2μm）；優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件、時(shí)間、電壓。

轉(zhuǎn)膜中的要點(diǎn)和建議

轉(zhuǎn)膜具體情況	要點(diǎn)和建議
大分子量蛋白	1）大的蛋白傾向于在膠里沉淀，阻礙轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)膜緩沖液里加入0.1%的SDS有助于解除上述現(xiàn)象； 2）甲醇傾向于從蛋白上移除SDS，因此把甲醇濃度降到10%甚至更少，有助于減少上述沉淀現(xiàn)象，適用于大分子量蛋白轉(zhuǎn)膜； 3）用4℃濕轉(zhuǎn)過(guò)夜代替半干法轉(zhuǎn)膜。
小分子量蛋白	1）SDS阻礙蛋白和膜的結(jié)合，但小分子量蛋白受到的影響更大。若轉(zhuǎn)膜的蛋白很小，可以考慮去掉緩沖液里的SDS； 2）保持甲醇濃度在20%； 3）對(duì)于非常小的蛋白，不要用半干法。
膜的方向確定	轉(zhuǎn)移后剪角做標(biāo)記，分清正反面；用鉛筆做記號(hào)或電泳時(shí)Marker上成非對(duì)稱的。
轉(zhuǎn)膜后背景高	選擇NC膜；另外，雞的抗體傾向于和PVDF膜及一些尼龍膜結(jié)合而導(dǎo)致高背景；可以換成NC膜以減少背景。
轉(zhuǎn)膜時(shí)污染	避免手指觸碰膜，可以用鑷子來(lái)取膜。手指上的油脂和蛋白質(zhì)會(huì)阻礙有效的轉(zhuǎn)膜，也會(huì)弄臟雜交。
濾紙的大小	確保濾紙和膜的大小與膠一致。當(dāng)使用半干法轉(zhuǎn)膜時(shí)，過(guò)多的部分會(huì)阻礙電流穿過(guò)膜。

原因分析4：抗體量不足；

解決方案4：增加抗體濃度，注意抗體儲(chǔ)存條件（避免反復(fù)凍融）；

抗體的保存和使用：

1 收到抗體后按要求離心后再打開(kāi)管蓋進(jìn)行分裝盒保存；

2 對(duì)于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃

2.1 分裝的量以一次實(shí)驗(yàn)用為好，最好不能少于10ul每份，因?yàn)榉盅b體積越小，抗體的濃度越可能受到蒸發(fā)及管壁吸附的影響；

2.2 復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來(lái)；

3 大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對(duì)抗體活性是沒(méi)有影響的。

任何時(shí)候，絕對(duì)避免反復(fù)凍融。

原因分析5：抗體孵育時(shí)間不足；

解決方案5：建議一抗4度孵育過(guò)夜；相對(duì)于2小時(shí)孵育，一抗4度過(guò)夜孵育會(huì)顯著增加抗體的結(jié)合。

/ 條帶彎曲 /

	原因分析1：條帶向上彎曲（︶條帶呈笑臉狀）：凝膠制備不均勻，中間冷卻不好；解決方案1：分離膠配好后用水壓線，保證水平，配膠緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)配，混合均勻后制膠。
	原因分析2：條帶向下彎曲（︵條帶呈皺眉狀）：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡；解決方案2：制膠架裝配好后，用水檢查是否有空隙再灌膠。
	原因分析3：條帶顯示不均勻，中空：可能凝固太快導(dǎo)致聚合不均勻；解決方案3：使用合適的促凝劑，制膠液混合好后及時(shí)灌膠

/ 彌散 /

	原因分析1：加樣過(guò)量；解決方案1：降低上樣量，推薦每孔上樣20-30ug。	原因分析4：電極不平衡，加樣位置偏斜；解決方案4：電泳槽水平放置，配膠時(shí)盡量小心，確保每個(gè)加樣孔完好無(wú)損。
	原因分析2：蛋白降解；解決方案2：使用蛋白酶抑制劑。
	原因分析3: 樣品溶解不好；解決方案3：樣品制備中一定要充分勻漿并超聲裂解。	原因分析5：樣品中含有不可溶顆粒；解決方案5：緩沖液配好后過(guò)濾除菌，樣品裂解保證可溶性